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姓名:急需了解     提问时间: 2005/7/5 22:08:45
邮箱:
问题:
 
请问张教授:我现在在做一个关于丁香试管苗可行性研究,对于丁香的国内外市场现状都不是很了解,你能给我一个建议吗?谢谢
 

回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:23:48

《植物组织培养 》
  书    号: 9787313038128
  作    者: 吴殿星 胡繁荣
  开    本: 16开
  装    订: 平装
  字    数: 340 千字
  页    数: 213页
  定    价: 24元
  出版日期: 2004-8-1

  内容简介:
    本书根据我国经济发展和产业结构调整的需要,以强化技术应用能力为主线,着眼于培养学生的应职综合能力和创新精神,提高学生的科学实验、生产经营、技术推广和组织管理等技能。
本书阐述了植物组织培养的基本理论、基本知识、基本技能和高新实用技术,主要包括:植物组织培养概述及基本技术、植物组织器官培养、茎尖分生组织培养、单倍体培养、细胞培养、原生质体培养和细胞融合、种质资源保存、植物遗传转化、组织培养苗的工厂化生产、药用植物的组织培养与工厂化生产、果树的组织培养、蔬菜的组织培养、观赏植物的组织培养、技能训练等,既引用了国内外最新理论成果,又突出了实用新技术,尤其是将可直接用于组织培养苗生产的具体操作技术和工厂化生产的经营管理内容编入教材,以更贴近生产实践。全书深入浅出、图文并茂,突出理论知识的应用和实践能力的培养,具有针对性、实用性、先进性和可操作性。
本书可作为全国高等职业技术学院、成教学院、高等农林专科学校、农林中专学校高职班园艺、园林、农学、应用生物技术、植物保护等专业的教学和相关层次培训的教材,也可供从事植物组织培养的技术工作者、研究人员和经营管理者参考使用。


 
目    录:
0 绪论……1
0.1 植物组织培养的基本概念……1
0.2 植物组织培养的发展简史……2
0.3 植物组织培养在农业生产中的应用……6
1 植物组织培养的基本技术……9
1.1 植物组织培养实验室的建立……9
1.2 培养基……20
1.3 外植体……29
1.4 培养条件……34
1.5 继代培养……35
2 植物组织器官培养……37
2.1 器官形成……37
2.2 根的培养……42
2.3 叶的培养……46
2.4 胚培养……48
2.5 胚乳培养……50
2.6 离体授粉……52
2.7 人工种子……54
3 茎尖分生组织培养……59
3.1 茎尖分生组织培养的目的与应用……59
3.2 茎尖分生组织培养的方法……60
3.3 脱毒苗的培育和病毒检测……63
3.4 脱毒操作与繁殖注意事项……73
4 单倍体细胞培养……75
4.1 花药培养……76
4.2 花粉培养……77
4.3 单倍体植株的鉴定和二倍化的方法……83
4.4 植物单倍体细胞培养的应用……86
5 细胞培养……88
5.1 单细胞分离……88
5.2 单细胞培养……90
6 植物原生质体培养和细胞融合……97
6.1 植物原生质体培养……97
6.2 植物细胞融合……103
7 种质离体保存……110
7.1 常温保存……110
7.2 常低温和低温保存……110
7.3 超低温冷冻保存种质……111
8 植物遗传转化……116
8.1 植物遗传转化的受体系统……116
8.2 农杆菌介导的植物基因转化技术……118
8.3 DNA直接导入的遗传转化技术……126
9 植物组织培养苗的工厂化生产……130
9.1 工厂化生产设施和设备……130
9.2 工厂化生产的技术……133
9.3 组培苗工厂化生产的工艺流程……140
9.4 组培苗工厂机构设置及各部门岗位职责……140
9.5 组培工厂设计中几项主要技术参数……144
9.6 生产规模与生产计划……145
9.7 组培苗的生产成本与经济效益概算……147
10 药用植物的组织培养与工厂化生产……150
10.1 利用红豆杉组织培养生产紫杉醇……150
10.2 银杏的组织培养与工厂化生产……152
10.3 桔梗的组织培养……154
10.4 半夏的组织培养……155
10.5 浙贝母的组织培养……156
11 果树的组织培养……160
11.1 葡萄的组织培养……160
11.2 草莓的组织培养与脱毒技术……161
12 蔬菜的组织培养技术……165
12.1 马铃薯的组织培养与脱毒技术……165
12.2 石刁柏的离体繁殖技术……168
12.3 结球甘蓝的组织培养……169
12.4 无籽西瓜的组织培养……171
12.5 结球莴苣(生菜)的组织培养……172
12.6 大蒜的组织培养……172
12.7 番茄的组织培养……173
12.8 大白菜腋芽培养技术……174
12.9 甘薯的脱毒技术……175
13 园林及观赏植物的组织培养……177
13.1 红掌的组织培养……177
13.2 杜鹃的组织培养……178
13.3 蝴蝶兰的组织培养……180
13.4 新几内亚凤仙的组织培养……183
13.5 月季的组织培养……184
13.6 百合的组织培养……186
13.7 郁金香的组织培养……186
13.8 荷包花的组织培养……187
13.9 山杜英的组织培养……188
13.10 高羊茅的组织培养……189
13.11 美国红叶石楠的组织培养……189
13.12 丽格海棠的组织培养……190
14 技能训练……192
14.1 培养基母液的配制……192
14.2 培养基配制与灭菌……194
14.3 培养材料的灭菌与接种……196
14.4 观看植物组织培养实验室和组培工厂化生产录像……198
14.5 胡萝卜离体根培养……198
14.6 猕猴桃茎段培养……200
14.7 百合鳞茎培养……201
14.8 水稻花药培养……203
14.9 细胞分离与细胞悬浮培养……206
14.10 菊花茎尖培养……208
14.11 组培苗工厂化生产的厂房及工艺流程设计……208
附录1 常用英文缩略语……210
附录2 常用植物生长激素浓度单位换算表……211
附录3 蒸汽压力与蒸汽温度对应表……212
参考文献……213


 

回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:25:48

常见园艺植物组织培养培养基配方

诱导培养
继代培养
生根培养
草莓
匍匐茎
1/2MS+BA0.2
1/2MS+BA0.5
1/2MS
吊钟海堂
叶片
MS+BA1.0+NAA0.2
MS+BA1.0+NAA0.1
MS+NAA0.2
海石竹
叶片
MS+BA1.0+NAA0.2
MS+BA1.0+NAA0.1
MS+NAA0.2
马铃薯
苗尖
MS+BA1.0+IAA0.01
MS+BA1.0+IAA0.01
MS+BA1.0+IAA0.01
分生组织
MS+NAA0.07+GA0.004
MS+NAA0.07+GA0.004
MS+NAA0.07+GA0.004
大蒜
顶端分生组织
MS
/
MS+NAA1.0
芽顶端
B5+2ip0.5+NAA0.1
B5+2ip0.5+NAA0.1
B5+2ip0.01+NAA0.2
洋葱
鲜茎
B5+2,4-D1
B5+2ip1
/
花椰菜
分生组织
LS+IAA8.0+KIN2.56
LS+IAA8.0+KIN2.56
LS+IAA8.0+KIN0.02
油菜
下胚轴、茎段
B5+BA1.5~2.0+IBA0.2+GA0.5
B5+BA1.5~2.0+IBA0.2+GA0.5
1/2B5+NAA0.05+IAA0.1
西瓜
苗端
LS+KIN1.0+IAA0.05
LS+KIN2.0+IAA0.05
LS+IAA2.0
葡萄
茎尖
MS+NAA0.1
MS+NAA0.1
/
麝香石竹
茎段
MS+BA1.0+IAA0.01
MS+BA1.0+IAA0.01
MS+IAA0.1
唐昌蒲
腋芽
MS+KIN2.0+NAA0.1
MS+KIN2.0+NAA0.1
MS+NAA0.5+AC0.3
月季
萌枝
MS+BA0.5+NAA0.1
MS+BA0.5+NAA0.1
MS+BA0.5+NAA0.1
非洲菊
茎尖
MS+KT1+IAA2
MS+KT10+IAA0.5
MS+IAA10
MS+BA2+NAA0.2~0.5
MS+BA2+NAA0.2~0.5
MS+White+IBA1
康乃馨
茎尖
MS+KT0.5+NAA0.1
MS+KT2+NAA0.02
/
MS+KT2+NAA0.2
MS+KT0.5+NAA0.02
/
仙客来
球茎
White+KT2.5
/
/
满天星
茎尖
MS(或White)+BA1+
NAA0.05
MS(或White)+BA1+
NAA0.05
/
香雪球
MS+IAA2+2,4-D5
MS+BA1+IAA0.02~0.2
/
变叶木
茎段
MS+BA1.5+NAA0.15
MS+BA2.5+NAA或IAA0.1
MS+NAA0.5
风信子
鲜茎、花序
MS+NAA0.5~10+2,4-D
0.2~1
/
/
矢车菊
Bonner+2,4-D0.7
/
/
大丽菊
侧芽
MS+BA1+NAA1
MS+BA1+NAA1
MS+NAA0.5~1


 

回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:30:31

植物组织培养苗之污染与检测

一、在组织培养中污染来源
1. 植物本身具有:
(1)植物病原菌
有些作物的病害已被透彻研究,因此在大量繁殖时,可立即检查出来,但有些则否,造成若有污染时,不知来源为何。
(2)和植物有关的菌类
有修植物本身便会和一些菌种共生,或是寄生于植物内部。
  
2. 植物所带入的污染:内在污染源
许多植物表面或大气中生存的微生物,可经由植物自然的开口或伤口进如植物内部,而有一些兼性腐生菌或绝对寄生菌,可藉由载体或是拥有一些侵入的机制侵入植物内部,依其存在的地方分为
1. 细胞内-inter
2. 细胞间隙-interacellular
种类有:virus病毒、viroids类病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜纲(ex:mite)、立克次体。
  
3. 操作室:外在污染源
   在组织大量培养下,除了植物本身外,大部分最有可能的污染来源便是来自操作室。依其可能原因分析为:
(1)空气
     在操作室中,未过滤空气带有大量的微生物,随者操作人员或植株接触时,而污染培养皿。故在国外对于操作室内空气的清洁度分为四种等级:
  ClassⅠ.没有容易培养的微生物,和作物之主要病原菌
    Ⅱ.没有容易培养的微生物,和作物特殊病原菌
    Ⅲ.没有容易培养的微生物
    Ⅳ.未做检测
(2)不完全的灭菌设备或技术
     因为使用灭菌不完全的设备或是技术,而导致植株或培养皿的污染,例如:有些酵母菌,可避免酒精消毒,还有一些会产生内孢子,而避免火焰消毒。
(3)人员
     在整个操作室内,人员可说是最大的带菌者,其不管在毛发或是衣服等,都隐藏属不清的菌。在进入操作室前,最好能将作业人员清洁处理,然后换上脱鞋,或是将尘土去掉。
(4)细缝的存在
因为若操作室有细缝的存在,则造成外果气体直接流入,使得空气中菌数增加。
(5)操作台上的滤网不干净
因为使用过久,或不当保养,而造成滤网坏掉,而产生更多的污染。
(6)蹒及蓟马的存在
此为珠形网,具有活动能力,能到处跑来跑去。因此常造成散乱的污染。
  
4.栽培过程污染
在栽培室,组培瓶外和外界气体交换时,亦会有污染进入。污染机率取决于空气中带菌密度与组培瓶空气交换率。
  
二、污染的种类及形式
1. 污染的形成
依据污染的来源,可将污染分为三个形式:
a.由植物内部或病原菌所造成的污染
植物内部或病原菌所造成的污染,所呈现是系统性,及从stageo~stage4中都可发现,而且占有一定的百分比。
a. 在制造时所造成的污染
如因蹒或是空气中的关系造成的污染,其所表现的方式是散乱(random)性非系统性,且不集中于某一地方,占的百分比也不一定,是机率性。
b. 技术上的失误
其呈现方式有一定性,例如由此工作台所生产得植株都被污染,表现为带状性,可用卷标方式来追踪,以进而改善。
  
2. 污染的来源分类
A.污染的种类,以总体来说可分为下列几种:
a.病毒(virus)-常存在植物内部。
b.(viroids)常存在植物内部
c.细菌-在组织培养中又分依其来源和所在地方分类如下:
  (a)     phlem-eimited生长于韧皮部
           xylem-eimited生长于木质部
(b)植物病原细菌
(c)空气中存在的细菌,但因植物有伤口,或是营养丰富的地方,可分为植物表面的细菌或植物内部的细菌。
例如:Bacillus spp.可抗热,在不完全灭菌的玻璃器皿中可发现。
(d)菌质体
是一种像细菌的微生物,但是本身没有细胞壁,可以在培养基培养,亦可用特殊的抗生素(四环霉素)抑制其生长。其种类有microplasm与spiroplasm。
(e)真菌
  在植物病害中,真菌所引起的病害特别多且严重,且因其会产生孢子,所以会随着空气飘散。一旦落于适当的环境下,一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落,污染整个组织培养瓶。例如常见的酵母菌,其菌落为粉红色,若有其出现,则其污染来源可能来自空气。
(f)蹒或蓟马
此为细小的微生物,具有活动能力,喜欢吃菌丝。在国内使用期限较久的组培场中常出现此问题。
(g)立克次体
目前未清楚其污染方式。
  
B.以培养难易区分污染源
1. 在培养基中易培养菌类
细菌,真菌,蹒。
2. 在培养基中不易培养的菌类
病毒,类病毒,立克次体,菌质体。
  
  在组织培养过程中,常造成污染或是造成威胁的菌类,称为培养菌类。因常为腐生菌,且营养需求不高(随便吃,随便活)所以常造成成本的增加。而且污染后,常使培养基的pH值降低,洋菜无法凝结,而使植物无法生长或是产生有毒物质或副产品,使得植物生长缓慢,或是干脆就在植物上生长。在培养基上不易培养或是不能培养的菌种,就不会造成太大的威胁。
  
C.各种菌种其主要传播方式
1. 病毒,类病毒,菌质体-常利用机械或利用有载体传播。
2. 细菌-可经人力,气流或水,及昆虫等传播。
3. 真菌-亦同上,但孢子可经空气传播。
4. 蓟马-同上,具活动力,自由运动,应慎防出现。
  
D.依其菌落生长出现的快慢区别
1. 可见的菌落在组织培养中。一些易培养的菌类,其生长特性为快速蔓延整个组培瓶。但此种污染可利用工作人员之视觉观察将之侦测出来将之销毁,对后代植株造成威胁不大。
2. 潜藏的菌落-在组织培养中有些不易培养或是在植物内部寄生或共生的菌类或病原菌,在培养时没有表现出来,但是有存在或只有很微弱的表现,但是未被察觉出来。于是便造成了对后代植株的重大威胁及成本的增加。
  
  其污染未明显表现出的原因有下列几项:
a在培养基中含有抗生素,则菌类不易生长。.
b.在培养基中,因植物本身的汁液含有某些特殊的成分例如:单宁酸,因此抑制菌类表现。
c.培养基成分不适合其大量表现,可能因营养需求不同。
c. 本身菌类生长方式不同:
例如病毒为绝对寄生菌,无法在一般培养基中培养。
  
E.依其植物栖息的地方分为:
1. 植物表面栖息的菌类
如:细菌,真菌。
2. 在植物内部共生寄生的菌类:
如:病毒,类病毒,细菌,真菌,菌质体。
3. 在大气中游移的菌种
细菌,真菌,蹒。
  
三、污染种类的鉴定方式
1. 针对培养难易菌种鉴定方式
A. 针对易培养的菌种:其种类为真菌,细菌
a.就真菌而言,主要是利用显微镜,视其孢子形态、产孢结构、及菌丝有无隔膜、还有细胞壁之形成加以鉴定。目前亦有使用DNA探针加以分析。
b.就细菌而言,则是利用其特殊的生化反应,或是利用选择性的培养基。目前亦有如用fatty acid profiling技术和商业化的test kits加以鉴定。
  
B不易培养的菌种,如菌质体,病毒,类病毒。
a.就菌质体而言,主要是观察其在培养基上菌落的形态。
b.病毒而言,分析其核酸的组成与例子的外形。
类病毒因没有套膜,以上两种常利用其DNA有同源性而做探针侦测。
  
C.病原菌的侦测
  利用柯霍氏法来测其病源性。而利用分子诊断,如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探针以鉴定种类。
  
2. 鉴定菌种常用的方式与应用的微生物种类
  
方法                     目标微生物
  
无种别性
指示培养               所有可培养的细菌
DNA/RNA 萤光染色法         菌质体及有关原核生物
Leaf dip electon microscopy        长条状的病毒,其数目较多者亦适用
电泳                 类病毒
有种别性
ELISA                 细菌及病毒
PALIAS                细菌及病毒
ISEM                  病毒
DNA探针                所有微生物
快速诊断的 kits             细菌
Fatty acid profiling            细菌

3. 一般对细菌的基本测试
a.Gram stain
b.形状
c.游动性
d.催化酵素的测试
e.氧化酵素的测试
f.热稳定性
g.行氧化作用或发酵作用
  
四、针对污染源常使用的防治方法
A. 种类
1. 热疗-对病毒较有效但须花费时间。处理时,需6-12星期在30-40℃。
2. 冷疗法-亦对病毒有效。
3. 利用抗生素。
4. 以分生组织,不带病毒等污染源。
5. 利用培养基中高糖,高盐的浓度。
6. 利用抗并毒药物。
7. 营养需求不同。
8. 利用水。
9. 抽样检测。
  
B. 防治方法之效果讨论
1. 热疗法及冷疗法
对病毒有效,但须花时间处理,例如:热疗法处理时间需花6-12星期在30-40℃。
2. 利用抗生素
这是目前较常用的方法,但是在抗生素加入培养基,其有效浓度常因植物具有半渗透功能,而使浓度无法达到有效浓度。使用抗生素时,需注意下列事项:
(1)要知道抑制的微生物为何,再使用抗生素,及对症下药。
(2)要决定最小抑制浓度,以降低成本。
(3)要确定抗生素不会对植物造成并害或突变。
(4)确定抗生素在培养基上是否有作用。
(5)使用时,常因需要而多种混合或交替使用。
(6)有些抗生素在某些国家是禁止使用,使用前必须做询问此药剂是否合法使用。
使用抗生素的缺点
(1)可能对哺乳类动物有害。
(2)若是使用生长期较长的植物,微生物亦有抗药性产生。
(3)容易错误使用:没有针对微生物而使用各种不同的抗生素。
  
抗生素的种类                            对象
  
抑制细胞壁合成
Bactracin                  G(+),杀菌,对抗β-lactams的菌有作用
β-lactams                 G(+),杀菌,若用10-100倍,则对G(-)有效
Glycopeptides              G(+),杀菌,但恨贵,不易有抗药性
抑制膜的形成            
plymixins                  对G(-)Psedomonas spp.有效
抑制蛋白质的合成
Ghloramphrnical            杀菌作用,便宜,但对植物有毒害作用
Aminoglycosides            使用对象广泛,对植物有毒害作用,在碱性环境下较有活性可针对G(-)可和盘尼西林(pencillins)一起作用
Macrolides and              对G(+)有静菌作用
Lincosamides
Tetracyclines               为静菌作用,对G(+)、G(-)都可以会刺激酵母菌,植物有害对
核酸抑制物质
Qutnolnes                 杀菌,对 G(+)有效,10-100倍浓度则对G(-)有效,有抗药性产生,可引起过敏反应易
Rifampicin                杀菌,对一些G(+)或G(-)的细菌有作用,但常有抗药性产生
Trimethoprim             对于一些 G(+)或G(-)的细菌有作用,Trimethoprim
Sulphonamides            Sulphonamides两种混合使用有加强的作用
                        Sulphonamides在碱性环境下较活跃
  
3. 分生组织法
主要是针对在植物内部寄主的菌类,如病毒等。因其生长速度无法长到顶芽的分生组织,所以在顶芽的分生组织则无病原菌存在。可以利用此分生组织培养成植株即可避免感染问题。
4. 利用培养基中高盐或高糖的浓度
在培养基中有一些高盐或高糖的浓度可抑制微生物生长,或有单宁酸的存在时也可以达到抑制效果。
5. 利用抗病毒药物
Ribaririn-对于ssRNA病菌有抑制作用,但是价格昂贵。
6. 营养需求不同
因为不同的菌类其营养需求不同,因此可利用选择性培养基可筛选或抑制一些微生物。
7. 利用水淹
利用水将植株清洗或是完全浸没,以避免其上的接种源四处扩散。
8. 抽样检测
对于后代植株的抽样检测,可将污染严重的个体去除。以上这些方法可以综合使用,以建立一个清洁的植株。
  
五、污染所造成的结果
1. 生产成本的提高。
2. 对植株造成伤害。
3. 增加接种源及污染的机率。
  
六、在组织培养过程各个阶段所应注意事项
(1)目前组织培养之流程主要分两种,如下图所示:

在此两种系统中,ModelⅠ和ModelⅡ之比较:
ModelⅠ:先做好一小批产品,再进入量产,此每一单位为一瓶,且自为独立环境,具区隔性,故有污染时所造成的伤害不大。
ModelⅡ:其为大容器系统,一旦有污染,则整批无法避免将会受到污染其培养基多为液体状态。
  
(2)                各阶段注意事项
stage0: 建立干净的植株,以利下面阶段的作业进行。只要建立无菌的植株,则污染的来源便只是来自技术上的失误。因此在此阶段要将病株丢除,并且将其具较多污染源的植株去掉。一般会选择较成熟的植株,因其病征易显现找到植株后。分离其菌或病原菌,做系列稀释以决定浓度。
stageⅠ:在stageⅠ的污染可蔓延培养基,故可利用“视觉”将之选出或丢弃,对于潜伏性或是表现微弱的菌种,需作特别的测试,在此阶段,要对一般的微生物作测试及对已知的病原菌作测试,若两种为负便可进入stageⅡ。stageⅡ要把污染的植株去掉,知道病原菌并重复分生组织的培养。
stageⅡ:在此阶段中,只有无菌的植株可繁殖。假设此植株为无菌,则污染源便来自操作室,故要先丢掉污染后,然后再取样抽检。
stageⅢ:如同stageⅡ。
stageⅣ:对后代植株需取样检查。
  
  
  
七、讨论

  目前组培苗污染实验所遇到的问题为不易建立植株的干净度,因此无法确定真正的污染源来自何处,无法对症下药。而且对于菌种的鉴定有很大的困难,因为一般有关植物或是植物病原菌,因为有钱人的资料留下,可叫易鉴定。但是对于目前一般在大气中生存的微生物,其背景资料较少,对于鉴定而言,便较棘手。而且目前商业化的test kites一般都是针对人体或是食品方面。对于可应用于植物的test kites太少。且使用ELISA或分子诊断,则因专一性太强,一旦有别种的微生物出现,则造成了无法侦测到而逸出。
  
  由上述这些资料可得知在组织培养的过程中,上流的技术会影响到下流的产量,而污染问题常在整个制造过中占有一定比例。对于如何控制污染,亟欲警系统的建立,和建立一个良好的工作环境,训练素质优良的员工,和干净的植株系统为组培业所要努力的方向。


 

回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:32:19

植物组织培养知识概要

植物组织培养(Plant Tissue Culture):是指通过无菌操作分离植物体的一部分(外植体explant),接种到培养基上,在人工控制的条件下(包括营养、激素、温度、光照、湿度)进行培养,使其产生完整植株的过程。(主要有原生质体(Protoplast),悬浮细胞,组织(愈伤组织Callus、茎尖分生组织),器官(胚,花药,子房,根和茎)的培养。其中最常见的是愈伤组织培养。)
愈伤组织(Callus):原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞,在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
植物细胞全能性(Cellular totipotency):任何具有完整细胞核的植物细胞,都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。(Haberlandt, 1902)
微(快)繁步骤(micropropagation):
母株(完整)→外植体(母株的一小部分,种子亦可)→接种到培养基上→长芽(继代增殖)→长根(试管外生根亦可)→练苗,驯化→完整植株
组培发展简史:细胞学说:SchleidenSchwann1.探索:20世纪初,Haberlandt提出“细胞全能性” (1902);1904年,Hanning培养萝卜和辣根菜的胚成功;Laibach(1925,1929)亚麻种间杂种胚培养成功,证明胚培养在植物远缘杂交上可利用;1922年,Robiins(美)和Kotte(德)离体根尖培养成功。2.奠基:GautheretWhiteNobecourt,组培奠基人。WhiteGautheret发现了 B族维生素和生长素;Skoog(1944)和Skoog  (1951)等发现腺嘌呤和生长素的比例控制芽和根的形成,Overbeek等(1941)首次将椰子汁(CM)作为添加剂,Steward等在胡萝卜组培也使用CM;1952年,MorelMartin首次证实通过茎尖离体培养可获无病毒植株;1953-1954年,Muir单倍体培养获得成功;1955年,Miller分离出激动素(KT);1957年,SkoogMiller提出植物激素控制器官形成的概念;1958年,Steward首次证实Haberlandt的细胞全能性设想;WicksonThimann指出CTK打破腋芽休眠;Murashige发展快繁技术;1958-1959年,ReinertSteward胡萝卜愈伤组培中形成体细胞胚。3.迅速发展:1971年,Takebe首次由烟草原生质体获得再生植株;1972年,Carlson获得烟草的第一个体细胞杂种;1964年,GuhaMaheshwari由毛曼佗罗离体花药培养胚;1960年,Morel提出离体无性繁殖兰花。……(具体see see书本或课件)
组培意义:1、基础理论研究(试验体系的准确性和可重复性,广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究(如分化问题))。2、应用研究(无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化,遗传育种,种质保存,克服远缘杂交,种质资源创新,获得转基因植株)。
组培应用前景:1、作物育种上的应用(1、花药和花粉培养2、胚胎培养3、细胞融合4、基因工程5、培养细胞突变体6、种质保存)2、作物脱毒和快繁上的应用(马铃薯,兰花)3、在植物有用产物生产上的应用4、在遗传、生理、生化和病理研究上的应用。
植物激素调控:auxin/CTK  >1(促进生根)  ;=1(愈伤组织)  ;<1(促进发芽)
脱分化(dedifferentiation):在组织培养中,不分裂的静止细胞,放在一定的培养基上后,细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。
再分化(redifferentiation):一个成熟的植物细胞经历了脱分化后,能再分化而形成完整植株的过程。
再分化途径:1、器官发生方式(是指在外植体或愈伤组织的不同部位分别独立形成茎、芽和根,它们为单极性结构,各有维管束与外植体或愈伤组织相连,但在不定芽和不定根之间没有共同的维管束将两者连在一起。)2、胚胎发生方式(外植体直接或通过愈伤组织或悬浮培养产生胚状体。)
胚状体(embryoid):是指在组织培养中起源于一个非合子细胞,经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。其特点有:1、不同于合子胚,因为它不是两性细胞融合产生。2、不同于孤雌/雄胚,因为它不是无融合生殖的产物。3、不同于器官发生方式形成的茎芽和根,因为它经历了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极性结构。
器官发生途径:1、茎尖或茎段培养产生腋芽。2、直接不定芽发生:器官的小块组织在培养基上培养直接诱导产生不定芽。3、间接不定芽发生:器官的小块组织在培养基上培养后先去分化形成愈伤组织,再经分化诱导产生不定芽或不定根。
胚胎发生方式:1、直接胚胎发生(从培养物中的器官组织,细胞或原生质体直接分化成胚,中间不经过愈伤组织)2、间接胚胎发生(外植体先愈伤化,然后由愈伤组织细胞分化成熟)
球型胚(global embryo)→心型胚(heart-stage embryo)→鱼雷型胚(torpedo-stage embryo)→子叶型胚(cytoledon-stage embryo)
人工种子:是指利用细胞的全能性将离体培养所产生的体细胞或具有发育成完整植株能力的分生组织(胚状体,茎和茎段)包裹在一层含有营养物质并具有保护功能的外膜内形成在适宜条件下能够发育成完整植株的小颗粒。
结构包括人工种皮,胚状体(分生组织),人工胚乳。
植物组织培养应用步骤:1、获得无菌外植体,建立起无菌培养体系。2、进行增殖,不断产生不定芽或胚状体。3、生根培养。4、试管苗移栽。
外植体选择的原则:1、必须含有活细胞。2、幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。3、母珠必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。4、母珠必须活跃生长并且不会立即进入休眠。
外植体的确定选择:1、茎尖(园艺植物组织培养中应用最多,繁殖率高,不易发生遗传变异,但取材有限);2、茎段(采用嫩茎的切段促进腋芽萌发,取材容易);3、叶(幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株,取材容易,操作方便,但易发生变异);4、花球和花蕾;5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
消毒的原则:消毒剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物,但应尽量减少对外植体细胞的破坏。
消毒方法:冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒→浸入70-75%乙醇,有利于植物表面的浸湿→用5-20%NaClO溶液(加1滴表面活性剂)表面消毒5-10min→用无菌水冲洗至少3遍→与消毒剂接触过的切面在转移到无菌培养基前应切去,因为消毒剂会杀死外露的细胞从而影响营养吸收→切取外植体,通常为10mm的茎段和直径10mm的叶片部分(太大激素作用减弱,太小则不易成活)。
消毒注意事项:1、表面消毒剂对植物组织是有害的,应正确选择消毒剂的浓度和处理时间,以减少组织的死亡。2、在表面消毒后,必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂,但若用酒精消毒,则不必漂洗。3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除,因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗,然后用其各个部分建立组织培养。5、HgCl2效果最好,但对人的危害最大,用后要用水冲洗至少5次。
茎尖培养:切取茎的先端部分或茎的分生组织部分进行无菌培养。
步骤:无菌培养的建立→芽的诱导→生根培养→试管苗的移栽(遗传变异)
注意点:试管苗移栽过程中,由异养→自养,恒温→温差,无菌→有菌,光弱→光强,湿度高→湿度低,应该保持苗的水分平衡(加塑料薄膜和使用喷雾机),选择适当的基质,注意光、温的条件。
安祖花:叶片→诱导愈伤组织→诱导芽→诱导根         生根
                                ↓                    ↑
                               增殖→切根→芽的增殖→再培养→壮苗→生根之前
不定胚的诱导:组织片→含有2,4-D的培养基上→产生不定胚→去除2,4-D的培养基上→球型胚→心型胚→鱼雷型胚→植物体。
不定芽的诱导:用BA诱导,在球、心、鱼雷时要去除BA。
胚胎培养的意义:1、对于胚乳发育不良或胚与胚乳间不亲和的材料进行离体胚培养,有助于远缘杂交获得成功。2、为研究胚在各个发育时期的营养需要提供了一个很好的机会。3、能对整个胚及其各部分的再生潜力进行研究。
胚培养中的两个重要问题:1、胚剥离的方法:剥离的最佳时间是授粉后13-15天。2、培养基的成分:找到合适的培养基,在胚培养中加入蔗糖(能源、保持适当渗透压)。
 
花药培养方法:
取材地点:大田和温室
取材:大多采用单核期的花粉培养,因诱导产生愈伤组织或胚状体的频率较高。
花粉时期的确定:常采用醋酸洋红-碘化钾染色,再压片镜检。实际操作中常根据花蕾长度、大小与花粉年龄的相关性确定。
预处理:低温、高温或交叉处理
培养基:有MS,Nitsch,Miller,B5和N6。低浓度的生长素和细胞分裂素相结合,高浓度的蔗糖对花粉的诱导生长有一定作用。培养基中加入活性炭对提高诱导频率也有一定效果。
消毒、接种和培养:花药→在烧杯中研碎(有溶剂)→过滤→浓度梯度离心→收集中间层→离心
单倍体的鉴定和加倍处理:单倍体用2%秋水仙素处理24小时,愈伤组织细胞自然加倍。
花粉花药培养的意义:1、在单倍体细胞中只有一个染色体组,表现型和基因型一致,一旦发生突变,无论是显性还是隐性,在当代就可表现出来,因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。2、在品种间杂交育种过程中,通过F1代花药培养得到单倍体后,经染色体加倍立即成为纯合二倍体,从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代和常规育种相比,显著缩短了育种年限。
花药培养步骤(用改良的NLN培养基)
F1代花药→形成小孢子→分离小孢子→形成愈伤组织→形成胚→单倍体植株→纯合二倍体
                     
                    形成胚→单倍体植株→染色体加倍形成纯合二倍体
原生质分离:酶(纤维素酶,离析酶)
步骤:叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体,用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。
原生质体的培养:
  培养基:MS+NAA 2.0ppm+BA 0.5ppm+3%蔗糖+9%甘露醇
  注意:1、原生质体分离后,非常脆弱,需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。
        2、针对不同的研究对象,培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。
  影响原生质体培养的因素:营养需求(NH4不能过多),渗压剂,培养密度(105/mL),
                          贮藏条件(通常在黑暗处)。
  培养方法:液体基质培养法,半液体基质培养法,固体基质培养法,看护培养。
  固体培养的步骤:原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖(40℃)的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细   
胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养,培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根,茎。
原生质体分离培养的意义:1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍,同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
原生质的融合概念:从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
体细胞杂交:完全不经过有性过程,只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。
原生质体融合方法:自发融合,诱发融合(NaNO3处理,高PH-高浓度钙离子处理,PEG处理,电融合)
  PEG法:
取材(1、从绿色叶片上分离得到的原生质体。2、来源于同种或不同种的细胞悬浮培养物上分离出的无色原生质体)-这样异核体和母体就可分辨开。
→分别取在含有13%甘露醇的CPW上悬浮培养的原生质体(密度2×105)4mL,混和在100g的转速下离心10min,将原生质体放入0.5%基质→加入30%(w/v)PEG 2mL,使原生质体的外膜不稳定,放置10min→每隔5min加入原生质体培养基稀释PEG以促进原生质体融合。每次稀释后轻微摇动原生质体就会重悬浮→混和物在100g下离心10min,离心后在不含PEG的培养基中清洗→离心,在相同的培养基上重悬浮。
PEG法的缺点:有毒,融合率低:不超过1%
对称融合:父母均未处理,对后代贡献一样。
不对称融合:父母本在后代中贡献不同,射线处理,化学处理
IOA(不影响核的分裂而影响细胞质分裂)
胞质杂种:利用原生质体融合技术,使两种不同来源的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起,就形成胞质杂种。
体细胞杂种和胞质杂种的鉴定方法:形态学,细胞学,分子遗传学。
园艺植物脱毒:
  热处理脱毒:
            原理:在高于正常温度下,植物组织中的很多病毒可被部分或完全钝化,而很
少伤害甚至不伤害寄主组织。
            方法:热水处理(对休眠芽效果好),热空气处理(对活跃生长的茎尖效果好)
热空气处理方法:空气温度35-40℃,持续时间:随处理对象不同而变化,几分钟-几星期。
        注意点:不能一下子放入高温中,要逐步加温使之适应。并保持湿度和光照。
        局限性:1、并不是所有的病毒都对热处理敏感
                2、对等径和线状的病毒及类菌质体引起的病害是有效的。
                3、热处理后只有一小部分植株能够存活
茎尖分生组织:指茎的最幼龄叶原基上方的一部分,最大直径约100μm,最大长度为
250μm。
茎尖:由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的。
茎尖培养脱毒:
原理:病毒在植物体内的分布是不均匀的,在受感染的植物中顶端分生组织通常不含或仅含低浓度的病毒,其它的植物组织离茎尖的距离越远则病毒含量越高。
影响茎尖培养脱毒效果的因素:培养基,外植体大小(脱毒效果跟外植体大小呈负相关,茎尖的成活率与茎尖大小呈正相关),贮存条件(光照培养优于暗培养),外植体的生理状态(活跃生长的芽,顶芽的效果比腋芽好,切割芽的时间)
通过愈伤组织培养脱毒:
                  原理:在由受感染的组织形成的愈伤组织中,并非所有的细胞都均匀一致地带有该种病原体。
              产生原因:1、病毒的复制速度跟不上细胞的增殖速度
                        2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的特征。
脱毒植物的鉴定:外观判断法,指示植物法(接种鉴定法),抗血清鉴定法,电镜检查法,
分光光度法,酶联血清免疫吸附反应鉴定法。
指示植物法:利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为鉴别病毒的标准。
指示植物:专门选用以产生局部病斑的寄主称为指示植物。
无毒原种的保存:种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中,隔离区内,通过组织培养繁殖。
组培常见英汉对照
abortion(败育)adenine(腺嘌呤)agar (琼脂)anther(花粉)apical(顶端的)aseptic(无菌的) auxin(生长素)axillary bud (腋芽)callus,calli(愈伤组织)cellular totipotency(细胞全能性) cellulase(纤维素酶)cellulose(纤维素)centrifuge(离心)chloroplast(叶绿体) chromosome doubling(染色体加倍)colony(细胞团,菌落)cybrid(cytoplasmic hybrid,胞质杂种) cytokinin(细胞分裂素) cytoplasm(细胞质)degeneration (败育)dedifferentiation (脱分化)redifferentiation(再分化)dicotyledonous(双子叶的)dihaploid(二单倍体)diploid(二倍体)dissect(剥离)dormancy(休眠)eliminate (除去) embryo(胚胎)embryoid(胚状体)embryogenesis(胚胎发生方式)epidermis(表皮,上表皮)excise(切除)explant (外植体)filter paper(滤纸) gelose(琼脂糖)genetype(基因型)germplasm(种质) global embryo (球型胚) haploid(单倍体)heterokaryon(异核体)homozygous(纯合的)hormone (激素)interspecific(种间的)intraspecific(种内的)in vitro(体外)in vivo(活体)kinetin(激动素)macerozyme(离析酶)male sterile(雄性不育)medium(培养基)membrane(膜)meristem(分生组织)meristem culture(茎尖培养)micropropagation(微繁)microspore(小孢子)monocotyledon/moncots(单子叶植物) nod culture (茎段培养)organelle(细胞器)organgenesis(器官发生方式)osmotic(渗透的)pith(髓)plantlet(小植株,苗)pollen culture(花粉培养)pollinate(授粉)protocorm(PLB)原球茎protoplast fusion(原生质体融合)rapid propagation(快繁)regeneration(再生)self-incompatibility (自交不亲和) shoot tip(茎尖) sodium hypochlorite(NaClO)somatic embryo(体细胞胚)somatic hybridization(体细胞杂交)somatic hybrid(体细胞杂种)stem(茎)stem tip culture(茎尖培养)sterilant(消毒剂)sterile distilled water(蒸馏水)sterilization(消毒)stock plant (母株)subculture (继代)  sucrose(蔗糖) terminal bud(顶芽)transfer (转移)virus eradication(脱毒)    
常用缩略语
ABA(脱落酸)        CM(椰子汁)        CPW(细胞-原生质体清洗液)
DMSO(二甲基亚砜)   IAA(吲哚乙酸)     IBA(吲哚丁酸)
KT(激动素)          NAA(萘乙酸)      PEG(聚乙二醇)
LH(液氮)            CH(水解酪蛋白)    GA3(赤霉素)

 

回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:34:58

我不知道上述几篇文献对您是否有用?再联系。
 

回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:40:46

云南绿大地生物科技股份有限公司技术开发中心是公司投资近 400 万元建设的研究开发机构,是发展高新技术产业、促进公司全面、协调、可持续发展的重要阵地。中心现有近 20 名老、中、青结合、学科专业较为合理的各类科技人员,设有植物组培技术开发室和花卉及观赏植物栽培技术开发室,已建成 1000 ㎡的组培楼和 2000 ㎡的温室及大棚,具备年产 100 万株植物组培苗的生产能力。
    中心的科技研发工作坚持以市场为导向,坚持以人为本,紧密围绕公司的发展战略目标,依靠科技进步和创新,为促进公司全面、协调、可持续发展提供科技支撑;中心坚持与省内外科研机构、高等学校和科技企业进行合作与交流,进行高新技术研究与产业化开发,不断提高企业的技术创新能力。目前,技术开发中心正与中国科学院昆明植物研究所、北京植物研究所、云南省林科院、思茅地区林科所及上海汉枫园林技术有限公司等进行合作,承担国家、云南省科技攻关计划重大项目,研究开发云南和国内外特色花卉、园林绿化树种新品种、新技术,已掌握十多种特色花卉和绿化树种的种苗培育核心技术,培育出数十万株组培试管苗、穴盘苗和盆栽苗产品,包括盆栽月季、茶花、系列秋海棠新品种、滇丁香及欧洲花楸等彩叶树种种苗。这些拥有自主知识产权的技术产品即将逐步投放市场或提供公司生产基地。

 

回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:43:00

云南绿大地生物科技股份有限公司的联系方式为:

昆明总公司
地址:昆明国家经济技术开发区A1-4#
邮编:650217
电话:0871-7278011
传真:0871-7278012
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          昆明总公司
 

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回复专家:张连翔,回复时间:2005/7/6 8:45:14

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回复专家:吕玉奎,回复时间:2005/7/6 9:31:49

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